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CLEM:整合光學(xué)電子顯微鏡優(yōu)勢

點(diǎn)擊次數(shù):1005 更新時(shí)間:2023-10-07


使用高壓冷凍技術(shù)的光電關(guān)聯(lián)顯微鏡


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近年來,光學(xué)顯微鏡研究以活細(xì)胞成像為主導(dǎo),而電子顯微鏡則被用于高分辨率研究。后來,人們逐漸有意將這兩種技術(shù)結(jié)合起來。整合之后的成果叫做光電關(guān)聯(lián)顯微鏡(CLEM)。電子顯微鏡提供的高分辨率使樣本制備過程中的人工產(chǎn)物同樣清晰可見。新版Leica EM ICE是一款帶有快速傳輸系統(tǒng)的高壓冷凍儀,允許光鏡電鏡相關(guān)實(shí)驗(yàn),能夠完好保存超微結(jié)構(gòu),避免出現(xiàn)此類人工產(chǎn)物。

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20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的綠色熒光蛋白(GFP)激發(fā)了人們此后對活細(xì)胞成像研究的濃厚興趣。而顯微鏡上配備的更快捷、更靈敏的檢測裝置則讓這種研究興趣愈發(fā)濃厚。生命科學(xué)從這些活細(xì)胞成像研究中獲取了大量的研究成果,很難想象要是沒有這些用具,生命科學(xué)將走向何種地步。


電子顯微鏡領(lǐng)域并未緊跟光學(xué)顯微鏡掀起的研究熱潮,但近年來有跡象表明光學(xué)顯微鏡的分辨率有時(shí)給人們解答科學(xué)疑問帶來了局限性。因此,人們愈發(fā)有意開發(fā)能將綠色熒光蛋白的活細(xì)胞成像功能和電鏡的高分辨率有效結(jié)合的新技術(shù)(見圖1)。綠色熒光蛋白在電鏡(電子顯微鏡)中并非直接可見,但可以通過抗體或光轉(zhuǎn)化顯現(xiàn)。


但這類方法只能用于在室溫下化學(xué)固定的樣本。有明確記錄表明這種做法會(huì)引入人工產(chǎn)物。這些人工產(chǎn)物在光鏡(光學(xué)顯微鏡)下不可見,原因可能是缺少固定劑(實(shí)時(shí)),或者在研究固定樣本時(shí)人工產(chǎn)物不在光鏡的分辨率范圍內(nèi)。


然而人工產(chǎn)物在電鏡下則顯而易見,這種成像能力正是我們在研究超微結(jié)構(gòu)時(shí)需要的高分辨率和精確細(xì)節(jié)。另外一種依靠物理固定的方法叫做冷凍固定。這種方法能更快固定細(xì)胞,并且和化學(xué)固定不同,這種方法并非選擇性固定。高壓冷凍(HPF)如今是冷凍固定細(xì)胞和組織可靠的方法。將樣本置于高壓下(2,000bar),數(shù)毫秒后在樣品上噴灑液氮。這樣做能避免冰晶形成和擴(kuò)散,并立即固定樣本,形成厚度可達(dá)200至300微米保存完好的玻璃化樣本。

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圖1:某CLEM實(shí)驗(yàn)圖解模型在現(xiàn)代CLEM實(shí)驗(yàn)中,首先將樣本(綠色細(xì)胞)置于光學(xué)顯微鏡下實(shí)時(shí)研究??梢愿櫽^察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(按箭頭)。當(dāng)出現(xiàn)有意思的現(xiàn)象時(shí),將樣本固定,并進(jìn)行電子顯微鏡觀察處理。將同一個(gè)細(xì)胞置于電子顯微鏡下追溯(灰色圖像),便可在高分辨率下研究感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和現(xiàn)象。




具備高時(shí)間分辨率的高壓冷凍技術(shù)

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圖2:Leica EM PACT2左(新版Leica EM ICE右) 高壓冷凍儀適用于標(biāo)準(zhǔn)高壓冷凍和光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)。操作非常簡便:只需插入快速樣品托,剩下的就交給儀器搞定。

高壓冷凍設(shè)備最初并非是為這些類型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的,主要的限制在于在光鏡下研究樣本、發(fā)現(xiàn)特殊的稀有現(xiàn)象并將樣本轉(zhuǎn)移到高壓冷凍設(shè)備進(jìn)行固定這一過程所需的時(shí)間。對一名老練的技術(shù)員來說,這一過程至少需要30秒以上。到那時(shí),想要觀察的結(jié)構(gòu)可能早已發(fā)生變化或者消失(見圖1)。


于是,徠卡顯微系統(tǒng)聯(lián)手來自英國布里斯托沃克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Paul Verkade博士著手開發(fā)一種能夠進(jìn)行光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn),同時(shí)支持高壓冷凍技術(shù)且時(shí)間分辨率少于5秒的儀器。這項(xiàng)開發(fā)成果便是Leica EM PACT2 /新版Leica EM ICE(見圖2)。該儀器可自由移動(dòng),能移動(dòng)到任何光學(xué)顯微鏡所在位置。RTS指的是快速傳輸系統(tǒng)該系統(tǒng)由快速樣品托和傳輸系統(tǒng)本體組成,快速裝載機(jī)用于裝載樣品(見圖3),傳輸系統(tǒng)本體則固定在高壓冷凍設(shè)備上。待快速樣品托插入快速傳輸系統(tǒng)后,樣本被自動(dòng)圍住,并沿軌道快速傳送至內(nèi)部進(jìn)行冷凍。這個(gè)過程僅需2.4秒。這讓科學(xué)家有足夠時(shí)間將快速樣品托從光學(xué)顯微鏡下取出并放入快速傳輸系統(tǒng)。這一動(dòng)作可在1至1.5秒內(nèi)輕松完成,繼而將時(shí)間分辨率總體維持在4-5秒左右。然后便可對冷凍樣品做電子顯微鏡觀察處理。




冷凍替換標(biāo)準(zhǔn)

多數(shù)情況下,這一過程會(huì)涉及冷凍替換。冷凍替換是指清除樣品中的冷凍水和丙酮等溶劑,然后在低溫下進(jìn)行樹脂滲透和聚合。為此,徠卡顯微系統(tǒng)近期推出了配備EM FSP的Leica EM AFS2,它能自動(dòng)替換所有冷凍替代化學(xué)物,簡化科學(xué)家的工作。圖3是該實(shí)驗(yàn)示例。表皮生長因子(EGF)與量子點(diǎn)偶聯(lián)。量子點(diǎn)能產(chǎn)生熒光且電子密度高,是光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)研究中非常好用的標(biāo)記。表皮生長因子內(nèi)化30分鐘后出現(xiàn)在多泡體(MVB)中。多泡體以動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn),具有許多延伸部分并隨時(shí)間顯現(xiàn)和消失(見圖3c)。

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圖3:使用高壓冷凍進(jìn)行光鏡/電鏡關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn),先在光學(xué)顯微鏡下研究感興趣的細(xì)胞。在該細(xì)胞的DIC圖像上覆上紅色熒光量子點(diǎn)(見圖3a)。將感興趣的結(jié)構(gòu)包裹并實(shí)時(shí)跟蹤觀察。拍攝熒光圖像,顯示最后10秒序列(見圖3c)。在0秒時(shí),取出快速樣品托放入快速傳輸系統(tǒng)。對該細(xì)胞進(jìn)行冷凍和處理后,對其進(jìn)行追溯(比較圖3a和3b)。

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當(dāng)觀察到另一延伸部分出現(xiàn)時(shí),取走樣本并立即進(jìn)行冷凍。對該細(xì)胞進(jìn)行追溯便可在高分辨率下看見感興趣的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)??傊?,Leica EM PACT2或者新版Leica EM ICE搭配徠卡顯微顯微鏡為生命科學(xué)家提供了優(yōu)秀的解決方案,既豐富了他們的研究手段又有助于擴(kuò)展他們的學(xué)識(shí)。



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