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簡(jiǎn)化復(fù)雜的熒光多孔板檢測(cè)方法

點(diǎn)擊次數(shù)：892 更新時(shí)間：2023-08-09

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過(guò)程中以消除不需要的細(xì)胞，或者發(fā)生在成年人的愈合過(guò)程中，以消除身體的受損細(xì)胞，幫助預(yù)防癌癥。用多孔板進(jìn)行的Caspase檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使研究人員能夠研究細(xì)胞凋亡的早期階段。在這篇文章中，我們展示了MICA如何與熒光多孔板測(cè)定一起應(yīng)用，以提供*時(shí)空相關(guān)性的數(shù)據(jù)，并將串?dāng)_降至zui di。

U2OS細(xì)胞在加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素后，在13小時(shí)延時(shí)成像過(guò)程中拍攝標(biāo)記了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的圖像。

熒光檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)

多孔板對(duì)于需要更高通量的實(shí)驗(yàn)非常有用。它們能讓用戶收集384、96或24個(gè)不同的平行實(shí)驗(yàn)（或樣品）的數(shù)據(jù) [1]?，F(xiàn)代檢測(cè)試劑盒通常用熒光探針或染料來(lái)標(biāo)記感興趣的蛋白，然后再用熒光顯微鏡對(duì)每個(gè)孔板中熒光標(biāo)記的樣品進(jìn)行分析[2,3]。高通量的熒光多孔板檢測(cè)在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的很多實(shí)驗(yàn)中都有廣泛的應(yīng)用。幸運(yùn)的是，許多這類(lèi)熒光檢測(cè)的試劑盒在市場(chǎng)上可以買(mǎi)到，這有助于大大簡(jiǎn)化樣品制備，為用戶節(jié)省大量的時(shí)間和精力。

細(xì)胞凋亡和Caspase蛋白

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過(guò)程中以消除不需要的細(xì)胞，或在成年人的愈合過(guò)程中消除身體的受損細(xì)胞，幫助預(yù)防癌癥[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一個(gè)大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行中起著重要作用[5,6]。啟動(dòng)型caspases幫助啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，而執(zhí)行型caspases進(jìn)行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是執(zhí)行者型caspases[5,6,7]。caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有協(xié)調(diào)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的作用，而caspase-7有細(xì)胞脫離的作用[7]。

Caspase測(cè)定法

Caspase檢測(cè)可以研究細(xì)胞凋亡的早期階段。在這里，我們研究了caspase-3和capase-7被細(xì)胞毒性藥物（如星形孢菌素）激活的劑量依賴性。為了消除隨機(jī)效應(yīng)，在相同的條件下用不同濃度的一種藥物或多種藥物的組合，對(duì)多個(gè)檢測(cè)樣本進(jìn)行了研究。具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果通常需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)次。

Caspase檢測(cè)中的挑戰(zhàn)

caspase檢測(cè)透露的主要是caspase激活級(jí)聯(lián)開(kāi)始時(shí)的信息。然而，關(guān)于單個(gè)細(xì)胞的其他形態(tài)學(xué)或激活反應(yīng)的問(wèn)題仍未得到解答。Caspase檢測(cè)中加入更多的熒光染色劑可以獲得更多的信息，例如在凋亡過(guò)程中的細(xì)胞骨架行為或xi bao se su c介導(dǎo)的凋亡小體的組裝導(dǎo)致caspase-3和caspase-7切割途徑的激活[8]。在caspase檢測(cè)中要快速收集所有熒光標(biāo)簽的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)在規(guī)定時(shí)間間隔獲取整個(gè)樣本板上的數(shù)據(jù)，可能是很困難的。其次，很難快速并可靠地分離多達(dá)四個(gè)熒光標(biāo)簽的信號(hào)。最后，如果數(shù)據(jù)的獲取與caspase活性的檢測(cè)不是同步的，它們就不直接相關(guān)。

由于這些挑戰(zhàn)，在進(jìn)行caspase測(cè)定，特別是在結(jié)合額外的標(biāo)記以獲得更多信息時(shí)，常常會(huì)有一些擔(dān)憂。激活反應(yīng)前后和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可能會(huì)丟失或沒(méi)有時(shí)空即位置和時(shí)間方面的相關(guān)性。另外，熒光標(biāo)簽之間的串?dāng)_也會(huì)導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的誤解。

目前，大量的研究實(shí)驗(yàn)室可能沒(méi)有現(xiàn)成的用于這些檢測(cè)工作的所有儀器和顯微鏡。這個(gè)問(wèn)題通常通過(guò)使用多個(gè)研究小組和用戶的共享設(shè)備來(lái)解決，但這意味著可能需要很長(zhǎng)時(shí)間才能獲得所需的儀器。

這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果會(huì)影響根本性突破和獲得新的見(jiàn)解。

Mica介紹

Mica是全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個(gè)wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過(guò)使用這個(gè)顯微成像分析平臺(tái)，您可以從以下方面受益：

人人皆享：即使是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的用戶也能用MICA輕松設(shè)置復(fù)雜的檢測(cè)讀數(shù)。

觸手可及：MICA使得用戶能同時(shí)對(duì)4個(gè)標(biāo)記進(jìn)行成像，具有*的時(shí)空相關(guān)性。

ji zhi簡(jiǎn)化工作流程：MICA對(duì)4個(gè)標(biāo)記的同時(shí)采集以及后續(xù)AI驅(qū)動(dòng)的數(shù)據(jù)分析都顯著減少了工作流程步驟。

方法

MICA用于熒光多孔板檢測(cè)來(lái)研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（圖1）。制備U2OS細(xì)胞相關(guān)樣品，最后用星形孢菌素處理以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)有多個(gè)與凋亡早期階段相關(guān)的讀數(shù)。

結(jié)果

圖1結(jié)果顯示了星形孢菌素誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是應(yīng)力纖維的形成和線粒體膜電位的耗盡。

圖1：圖中顯示了實(shí)驗(yàn)工作流程和caspase檢測(cè)的結(jié)果。

用MICA實(shí)現(xiàn)了4種熒光標(biāo)記物的絕對(duì)時(shí)空相關(guān)性，由此可以對(duì)凋亡誘導(dǎo)的早期進(jìn)行監(jiān)測(cè)（參考視頻1和圖2）。觀察到應(yīng)力纖維的形成與caspase-3和caspase-7激活開(kāi)始時(shí)線粒體膜電位的喪失相吻合。DNA凝結(jié)直接跟隨caspase激活。

視頻 1：U2OS細(xì)胞在63倍寬場(chǎng)模式下采集13小時(shí)的延時(shí)拍攝視頻。A) 細(xì)胞用SiR-Actin、TMRE（63倍放大，線粒體活性）、CellEvent™（caspase活性）和DAPI（細(xì)胞核）標(biāo)記。在t0加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素。

圖2：同一數(shù)據(jù)集，每列顯示單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每行顯示單個(gè)標(biāo)記。

圖3為傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡和MICA的時(shí)空多色采集對(duì)比。熒光標(biāo)記的同步檢測(cè)在研究線粒體動(dòng)力學(xué)時(shí)，消除了觀察線粒體結(jié)構(gòu)和膜電位時(shí)的時(shí)空偽影。使用傳統(tǒng)寬場(chǎng)成像時(shí)，由序列采集產(chǎn)生的時(shí)空偽影會(huì)使測(cè)量結(jié)果失真，并影響結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性。MICA的FluoSync技術(shù)能同時(shí)采集并確保時(shí)空相關(guān)性，采集時(shí)沒(méi)有偽影，膜電位與線粒體結(jié)構(gòu)正確相關(guān)。

圖3：MICA的63x/1.2 W PL Apo CS2 SmartCORR物鏡在寬場(chǎng)模式下拍攝的用MitoTracker™綠色（青色）和四甲基羅丹明乙酯（TMRE，品紅）染色的U2OS細(xì)胞圖像。A) 序列采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，其中裁剪圖像顯示由于序列采集兩個(gè)通道之間出現(xiàn)了時(shí)空偏移。B）同時(shí)采集MitoTracker™綠色通道和TMRE通道，裁剪的圖像顯示兩個(gè)通道之間沒(méi)有任何時(shí)空偏移。兩個(gè)通道保持共定位，并能夠?qū)γ總€(gè)MitoTracker™綠色結(jié)構(gòu)（線粒體結(jié)構(gòu)）中的TMRE信號(hào)（線粒體膜電位）進(jìn)行量化測(cè)量。比例尺為5µm。

與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡不同的是Mica FluoSync[10]可以同時(shí)進(jìn)行4色標(biāo)簽成像、寬光譜譜檢測(cè)和拆分[9] （參加圖4）。

圖4：A) 傳統(tǒng)寬場(chǎng)4色熒光成像使用帶通熒光發(fā)射濾波器：結(jié)果是染料分離度差，導(dǎo)致定位精度低，切斷信號(hào)式減少串?dāng)_，序列成像慢。B) 帶FluoSync技術(shù)的MICA可以同時(shí)進(jìn)行4個(gè)標(biāo)簽的成像，寬光譜檢測(cè)和拆分[9]進(jìn)行真正的染料分離，以及4倍的同時(shí)成像速度。

參考資料

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W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
C.P. Austin, Apoptosis, National Human Genome Research Institute (NHGRI), National Institutes of Health (NIH).
R. Jan, G.-e-S. Chaudhry, Understanding Apoptosis and Apoptotic Pathways Targeted Cancer Therapeutics, Adv. Pharm. Bull. (2019) vol. 9, iss. 2, pp. 205-218, DOI: 10.15171/apb.2019.024.
S. Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Toxicologic Pathology (2007) vol. 35, iss. 4, pp. 495–516, DOI: 10.1080/01926230701320337.
J.G. Walsh, S.P. Cullen, C. Sheridan, A.U. Lüthi, C. Gerner, S.J. Martin, Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases, PNAS (2008) vol. 105, no. 35, pp. 12815-12819; DOI: 10.1073/pnas.0707715105.
S. Cullen, S. Martin, Caspase activation pathways: some recent progress, Cell Death Differ. (2009) vol. 16, iss. 7, pp. 935–938, DOI: 10.1038/cdd.2009.59.
F. Cutrale, S.E. Fraser, A New Method for Convenient and Efficient Multicolor Imaging: Interview, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

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